在分子生物學的研究當中,分子與分子之間的互作關系是極其重要的課題,而在這其中,蛋白質與 RNA 分子的互作則是為轉錄水平調控以及轉錄后調控創造了豐富的可能性。 

RIP-seq,全稱 RNA Immunoprecipitation Sequencing,該技術從一種已知的蛋白質出發,使用針對該蛋白的特異性抗體將目標蛋白以及與其結合的 RNA 復合物沉淀下來, 進而對富集到的 RNA 進行分離和建庫測序,從而揭示 蛋白質-RNA 之間的結合關系。 

RIP-seq 擁有廣泛的應用場景,例如:通過針對 AGO2 蛋白的 RIP-seq,可以獲取參與 RNA 干擾以及 miRNA 海綿機制的相關 RNA 的信息;通過針對特定 RNA 修飾酶的 RIP-seq,可以知曉該 RNA 修飾酶的靶位點;通過針對特定 RBP(RNA 結合蛋白)的 RIP-seq,可以獲知 RBP 結合并調控的靶基因…… 由于其在分子機制研究上的出色表現,RIP-seq 已經成為高分論文的利器。 

RIP 實驗的成敗是決定測序數據質量的關鍵因素。云序生物經過多年的經驗積累,自研開發了商業化的 Genseq RIP 試劑盒,為 RIP 實驗的成功率和穩定性保駕護航。云序生物實驗室也承接 RIP-seq 以及 RIP-qPCR 業務,提供從樣品處理,文庫制備,上機測序到數據分析的一站式技術服務,助力復旦大學醫學院、上海交通大學醫學院、中科院上海植物生理生態研究所、華南農業大學動物科學學院在內的諸多研究機構的客戶發表了十余篇 RIP-seq 論文,其中不乏登上 Nature 子刊、Cell 子刊的高水平研究。

以下幾篇精彩案例不容錯過:

案例 1 

論文標題:Hypoxia regulates overall mRNA homeostasis by inducing Met1-linked linear ubiquitination of AGO2 in cancer cells

發表期刊:Nature Communications (IF=17.694)

作者單位:上海交通大學醫學院

樣品類型:人類 HeLa 細胞系

詳細解讀:RIP-seq項目文章|nature子刊揭示低氧誘導AGO2線性泛素化調控腫瘤發生發展機制 

miRNA 對 mRNA 的表達沉默作用需要 AGO2 蛋白的介導。在常氧和缺氧兩種環境下,作者針對 AGO2 蛋白進行了 RIP-seq 實驗,揭示了缺氧處理對 AGO2 結合的 mRNA 的影響。累積分數分析顯示,缺氧顯著降低了 mRNA 與 AGO2 的相互作用。通過包括 miRNA 測序在內的一系列后續實驗,作者發現缺氧誘導 AGO2 與 HOIP 以及 HOIL-1L 等的相互作用,它們與 miRNA 誘導的沉默復合物(miRISC)共定位,進而催化 AGO2 蛋白發生 Met1 殘基連接的泛素化(AGO2 M1-Ubi )。通過 RIP-seq 結果與 mRNA-seq  結果的比較,作者證實 AGO2 M1-Ubi 機制可以降低本應受 miRNA 調控的靶 mRNA 與 AGO2 的結合,從而造成 mRNA 的積累。 

案例 2

論文標題:Translational Regulation of Plant Response to High Temperature by a Dual-Function tRNAHis Guanylyltransferase in Rice

發表期刊:Molecular Plant (IF=21.949)

作者單位:中科院上海植物生理生態研究所

樣品類型:水稻種子

詳細解讀:云序客戶再發高分文章,教你如何玩轉tRNA機制研究

作者通過包括  tRNA-seq  在內的一系列實驗,發現 tRNAHis 表達量的異常,進而發現一個 tRNAHis 的鳥苷酸轉移酶 AET1,它有助于 pre-tRNAHis 的修飾,并且對水稻在高溫條件下的正常生長不可或缺。作者隨后針對 AET1 蛋白進行了 RIP-seq,發現了 208 種 mRNA 在高溫條件下與 AET1 蛋白結合。RIP-seq 的聚類熱圖顯示植物生長素相關基因存在明顯的組間差異,其中 OsARF 基因最為明顯。作者隨后進行了 RIP-qPCR 驗證,確認了高溫環境下 AET1 蛋白與 OsARF 基因的主要開放閱讀框(mORF)以及上游開放閱讀框(uORF)均存在結合。作者隨后還進行了翻譯組水平的一些實驗,證明 AET1 通過 tRNA 影響水稻植物生長素信號相關蛋白的表達。這些發現為AET1通過在tRNA修飾和翻譯控制中發揮雙重作用來調控水稻的環境溫度反應的分子機制提供了新的見解。

 案例 3

論文標題:SUMOylation of YTHDF2 promotes mRNA degradation and cancer progression by increasing its binding affinity with m6A-modified mRNAs

發表期刊:Nucleic Acids Research(IF= 19.16)

作者單位:上海交通大學醫學院

樣品類型:人類肺癌細胞系

詳細解讀:云序客戶余健秀課題組m6A方向再次取得重大發現——SUMO化促進YTHDF2結合m6A修飾的mRNA影響癌癥進展

RNA m6A 修飾的閱讀蛋白 YTHDF2 在體內和體外的主要部位K571被SUMO化,它可以被缺氧誘導,而被氧化壓力和SUMO化抑制劑減少。YTHDF2的SUMO化對其泛素化和定位的影響不大,但會大大增加其與m6A修飾的mRNA的結合親和力,隨后導致基因表達的失調,這也是癌癥發展的原因。此外,來自TCGA數據集的肺腺癌患者的無病生存分析顯示,YTHDF2的高表達和SUMO1的高表達預示著不良的預后。此項研究揭示了YTHDF2識別m6A-RNAs的一個新的調節機制,并強調了YTHDF2的SUMO化在轉錄后基因表達調節和癌癥進展中的重要性。

案例 4

論文標題:The RNA binding protein SORBS2 suppresses metastatic colonization of ovarian cancer by stabilizing tumorsuppressive immunomodulatory transcript

發表期刊:Genome Biology(IF= 17.906)

作者單位:四川大學華西醫學院

樣品類型:人類卵巢癌細胞系

詳細解讀:叕一篇!云序客戶高分文章,教你如何巧用RIP測序玩轉分子機制!

本文揭示了RNA結合蛋白SORBS2在卵巢癌腫瘤細胞轉移過程中的重要生物學作用。從數據庫搜索,到通過RIP-seq鎖定SORBS2靶基因,RIP-seq 聯合全轉錄組測序的相關生物信息學分析提示SORBS2結合并穩定部分轉錄本,其中WFDC1和IL-17D作為SORBS2結合的重要靶點可以抑制卵巢癌細胞的轉移灶的定殖。相關結果提出了一個全新的連接癌癥發展和免疫調節的轉錄后調控網絡,這一網絡依賴于SORBS2結合并穩定轉錄本的重要生物學作用。

案例 5

論文標題:Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition

發表期刊:RNA Biology (IF= 4.766)

作者單位:華南農業大學動物科學學院

樣品類型:雞肝臟組織

詳細解讀:云序手把手教您如何應用RIP和RNA pull down技術——研究RNA分子互作機制沖擊高分文章

這篇文章主要研究circRNA Vav3通過吸附gga-miRNA-375促進雞肝癌的EMT過程,也是運用了RIP-PCR和RNA pull down-PCR實驗探究了circRNA Vav3能夠吸附gga-miRNA-375的機制

案例 6

論文標題:Attenuation of Piwil2 induced by hypoxic postconditioning prevents cerebral ischemic injury by inhibiting CREB2 promoter methylation

發表期刊:Brain Pathology(IF=7.611)

作者單位:廣州醫科大學

樣品類型:大鼠腦組織

詳細解讀:用戶文章,1區 | 新型非編碼RNA piRNA測序揭示腦缺血神經損傷機制

作者在本文中描述了 Piwil2在通過表觀遺傳機制調節 CREB2表達和介導大鼠 tGCI (短暫全局性腦缺血)后 HPC (低氧后處理)的神經保護中的作用。HPC 下調了 tGCI 后 CA1區域中 Piwil2的表達,作者通過針對 Piwil2 蛋白的 RIP +  piRNA-seq  發現了組間差異 piRNA 共同調控的基因:DNA 甲基轉移酶 DNMT3A。DNMT3A 反過來消除了 tGCI 誘導的 CREB2啟動子甲基化的增加,從而增加了 CREB2在 mRNA 和蛋白質水平。此外,HPC 誘導的 Piwil2的減少起到了恢復樹突復雜性和樹突長度的作用,并阻止了 CA1區域神經元樹突棘的喪失,從而改善了 tGCI 后大鼠的學習和記憶功能。

RNA免疫沉淀(RIP)技術介紹

01 RIP實驗原理

RIP技術(RNABinding Protein Immunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉淀),是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術,是了解轉錄后調控網絡的有力工具。運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析,結合的RNA可以通過定量PCR(RIP-PCR)或高通量測序(RIP-seq)方法來鑒定。

02 RIP-seq技術簡介

這種技術運用針對目標蛋白的抗體把相應RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。RIP-Seq將RIP技術與高通量測序相結合,能夠高通量地檢測與特定蛋白結合的RNA,從而解析全轉錄組范圍內的目標蛋白-RNA相互作用網絡。云序生物是業內少數的既做前端高通量測序篩選,同時實現一站式解決功能機制的科研服務公司。在各RNA分子研究火熱的現階段,更多科研工作者想要在通過高通量篩選到目的基因后,解決RNA的分子機制問題,云序提供的RIP和RNA pull down技術正好解決分子機制的核心技術難點。

03 RIP試劑盒

GenSeq®RNA免疫沉淀試劑盒(RIP試劑盒),應用于RNA-蛋白質互作研究。通過RIP方法,可以檢測與特定蛋白結合的RNA,從而為研究分子機制提供強勢助力。優化過的實驗流程后獲得的蛋白結合RNA可以廣泛應用于后續的定量RT-PCR,高通量測序以及其他檢測分析。

 云序生物服務優勢 

優勢一:一站式服務,客戶只需提供細胞,組織RIP后 RNA,云序生物為您完成從樣品處理,文庫制備,上機測序到數據分析整套服務流程。

優勢二:商業化的RIP試劑盒RIP實驗的成敗是決定數據質量的關鍵,云序生物采用商業化RIP試劑盒,保證了RIP實驗的成功率和穩定性。

優勢三:嚴格的質控,云序生物在實驗的各個關鍵步驟加入了一系列質控點,全程監控實驗質量,確保客戶得到優質的數據。

優勢四:專業化的生物信息分析,云序生物具有強大的生物信息學團隊,能夠滿足客戶的各類深入數據分析要求。

相關產品 

根據已知分子和目標分子的不同,常見的蛋白質-RNA 互作研究的實驗方法有如下幾種類型:

RIP-seq

RNA-Pull Down

CO-IP

雙熒光素酶驗證Label free蛋白質譜TMT 蛋白質譜

RNA-seq

mRNA-seq

miRNA-seq

mRNA-qPCR

miRNA-qPCR

RIP試劑盒

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